大家好，今天给大家分享的文献发表在JACS上，标题为EvolvedDNADuplexReadersforStrand-AsymmetricallyModified5?Hydroxymethylcytosine/5-MethylcytosineCpGDyads，通讯作者为德国多特蒙德工业大学的DanielSummerer教授

5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是哺乳动物DNA的两种主要表观遗传修饰，在CpG双链的两条链中以对称和不对称组合形式存在。然而，揭示单个DNA双链体中的这种组合是一项重大挑战。

在本文中，作者通过细菌细胞表面展示系统，进化出源自MeCP2的甲基-CpG结合域(MBD)针对hmC/mCCpG的第一个亲和探针。该探针对单个hmC/mCCpG具有低纳摩尔亲和力，并且可区分其他14个修饰的CpGDyads。结果研究表明，这种蛋白质具有保守的支架，可以识别具有hmC和mC。该探针能够从基因组DNA背景中选择性地富集含有hmC/mC的DNA片段。

作者采用参与扩散粘附-I(AIDA-I)自转运蛋白的粘附素在大肠杆菌细胞表面来展示MBD的识别能力（图1c），用于开发一种快速分配多个靶向和脱靶CpG修饰选择性的选择系统。为了设计能够识别链不对称修饰的CpGdyads的蛋白质探针，作者从野生型MeCP2的MBD开始，选择了四个紧邻mC碱基的残基并通过NNK密码子变性进行诱变：S、Y、V和K。同时作者保留了R和R，它们通过两个甲基-精氨酸-鸟嘌呤三联体赋予特异性识别不同修饰的CpG的能力（图1a,b）。在建立功能性MBD显示的条件后，作者使用wtMBD和含有mC/mC或C/CCpGDyads（用两种颜色标记）的dsDNA进行了第一次模型选择，该测定提供了低假阳性率（图1d）。

图1MBD蛋白的定向进化方法

作者筛选了MBD文库，以找到识别hmC/mCCpG的探针。在对选择性hmC/mC结合蛋白进行两轮迭代筛选后，作者观察到富集（图2a）。在第二轮选择之后富集最高的氨基酸取代是KT，VT或VC，SN或SK，但是随机化的Y并未收敛到特定的氨基酸取代（图2b）。在最后的分选步骤之后，消除Y的两种表型（T/T/Q/K和T/T/T/K）显示出类似的mC/mC和hmC/mC结合，而其他两种保留Y的表型（T/C/Y/N和T/A/Y/N)与hmC/mC的结合，比与mC/mC、C/C、hmC/C或hmC/hmC更强（图2c）。

图2通过定向进化将wtMeCP2的选择性从mC/mC转化为hmC/mC

接下来作者对MeCP2T/A/Y/N的完整选择性曲线进行测定，天然蛋白和进化突变体之间的选择性相差倍。该突变体不仅可以区分原始的CpGdyadmC/mC，还可以区分所有14个脱靶CpGdyads（图3a）。与野生型相比，重组表达的T/A/Y/N（和T/C/Y/N）对CpGdyadshmC/mC的选择性更高（图3b）。定量分析显示，对于T/A/Y/N，单个hmC/mCCpG的表观Kd比相同情况下的mC/mCCpG低9.4倍。然而，wtMeCP2与mC/mCCpG的结合强度比与hmC/mCCpG的结合强度高11.8倍（图3c）。最后作者在两个不同的天然脊椎动物启动子序列（Hey2和CDKN2A）验证该探针的效果。T/A/Y/N在这些序列中对hmC/mCdyad的选择性也比mC/mCdyad高5.5倍和1.5倍，而wtMeCP2显示的mC/mC比hmC/mC高（图3d）。该数据表明新型探针的选择性不限于特定的序列。

图3hmC/mC选择性读取器MeCP2T/A/Y/N的生化表征

最后，作者在实际样品中测试MeCP2T/A/Y/N用于分析基因组DNA背景中含有的hmC/mCDNA片段的亲和富集的能力。作者将C/C、mC/mC或hmC/mCDNA双链体的混合物掺入到人类基因组DNA(gDNA)中（图4a）。引入的hmC/mC修饰的CpG对应于样品中所有CpG的0.7%。在本文中，wtMBD显示mC/mC比hmC/mC富集2.5到3.5倍，相比之下，T/A/Y/NMeCP2显示hmC/mC比mC/mC或C/C富集3.5到4.5倍（图4b）。此外，作者还从HEKT细胞中获得了相同或自然甲基化gDNA背景的样本，其中包含了个spike-ins，并获得了类似的结果（图4b）。

图4MeCP2T/A/Y/N从基因组DNA背景中选择性和灵敏地富集hmC/mCCpG

综上所述，作者开发了一种基于大肠杆菌细胞表面展示的MBD快速筛选系统，并用它来进化出第一个针对hmC/mCCpGdyads的亲和探针。该探针积极且选择性地识别所有15种可能的修饰CpGDyads中的hmC/mC，并与自然的wtMBD对mC/mC的选择性相媲美。除了能观察到新探针的选择性外，预计它将成为研究hmC/mC标记在染色质生物学各个方面的功能的有用工具。

供稿人：邵文铉，武汉大学

审核：袁必锋、王敏、闵奕豪，武汉大学

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