高效液相色谱法

1.与气相色谱比拟液相色谱的长处与气相色谱法比拟，液相色谱法不受样本挥发性和热不变性及相对分子品质的束缚，唯有求把样本制成溶液便可，稀奇适当于别离生物大分子、离子型化合物，不不变的自然产品以及其余各样高分子化合物等。另外，液相色谱的震动相不光起到使样本沿色谱柱挪移的效用，况且与强固相相同，与样本分子产生取舍性的彼此效用，这就为遏制和改进别离前提供应了一个额外的可变要素。而气相色谱法采纳的震动相是惰性气体，对组分没有亲和力，仅起运载效用。2.液相色谱特性：高压、高速、高效、高机灵度、高沸点、热不不变有机及生化试样的高效别离解析法子。3.高效液相相色谱仪的构成：高压输液系统、进样系统、别离系统、探测系统、数据处置系统。4.震动相应用前必需脱气：罕用的脱气法子有：低压脱气法(电磁搅拌、水泵抽暇，可同时加热或向溶剂吹氮气)、吹氦气脱气法和超声波脱气法等。5.梯度洗脱：用两种(或多种)不同极性的溶剂，在别离流程中按必要程序持续改动震动相中溶剂的配比和极性，经过震动相中极性的变动来改动被别离组分的别离要素，以提升别离成果。6.高压梯度(内梯度)：特性是先加压后搀和，将溶剂用高压泵增压往后输入色谱系统的梯度搀和室，加以搀和后送入色谱柱。低压梯度(外梯度)：特性是先搀和后加压。在常压下预先按必要的程序将溶剂搀和后再用泵输入色谱柱。7.进样系统请求：杰出的密封性，最小的死体积，最佳的不变性，进样时对色谱系统压力、流量影响较小。8.别离系统：色谱柱是完结别离的重心部件。由柱管和强固相构成。柱管为直型不锈钢管。通常色谱柱长5~30cm，内径4~5mm，凝胶色谱柱内径3~12mm，而制备色谱柱内径则可达25mm。通常淋洗溶剂在投入色谱别离柱以前，先经过前置柱。HPLC柱的填料颗粒粒径通常约为3~10m，填充常采纳匀浆法，色谱柱的进展趋向是减小填料粒度和柱径以提升柱效。9.探测系统：效用——用来持续监测经色谱柱别离后的流出物的构成和含质变动的安设。紫外-看来摄取探测器、光电二极管阵列探测器、示差折光探测器、荧光探测器、电化学探测器。10.高效液相色谱法对震动相的请求：震动相不与色谱柱产生不行逆化学变动，以维持柱效或柱子的保存性质较万古间不变;应付测样本有充裕的消融技能；与所用探测器相般配；粘度尽或许小，以得到较高的柱效；震动相纯度要高，价钱廉价，毒性小。11.高效液相色谱法的强固相的分类：(1)按强固相经受压力分：刚性固体：以二氧化硅为基质，可经受较高压力，表面可键合各样机能官能团——键合强固相，是方今运用最宽泛的强固相。硬胶：首要用于离子相易色谱法和凝胶色谱法中，由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，可经受的压力较低。(2)按孔隙深度分：表面多孔型：基体是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一层多孔活性物资如硅胶、氧化铝、聚酰胺、离子相易树脂、分子筛等。长处：实用于神速别离、填充平均慎密、板滞强度高、能经受高压，适于简明的样本及通例解析；瑕玷：多孔层薄，进样量受束缚；全多孔型：由硅胶颗粒凑集而成，比表面积大，柱容量大，小颗粒全孔型强固相孔洞浅传质速度快，柱效高，别离成果好，适当于繁杂样本、痕量组分的别离解析，是方今HPLC中运用最宽泛的强固相。12.液固吸附色谱法道理：因而固体吸附剂为强固相，吸附剂表面的活性中间具备吸附技能，试样分子被震动相带入柱内时，它将与震动相溶剂分子在吸附剂表面产生比赛吸附。别离流程是一个吸附-解吸的均衡流程。13.液固吸附色谱法强固相：时常是硅胶、氧化铝、活性炭等固体吸附剂，硅胶最罕用；震动相：极性大的试样需用极性强的洗脱剂，极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。运用：几多异构体别离和族别离，如农药异构体；煤油中烷、烯、芳烃的别离。不适于强极性的离子型样本的别离，不适于别离同系物(由于，它对相对分子品质的取舍性较小)。14.液液分派色谱法道理：依照物资在两种互不相溶(或部份互溶)的液体中消融度的不同完结别离，分派系数较大的组分保存值也较大。15.液液分派色谱法震动相：震动相与强固液应只管不互溶，或许两者的极性出入越大越好。依照震动相与强固相极性的差异水平，可将液液色谱分为正相分派色谱(震动相极性小于强固相极性，极性小的先流出，适于强极性和中等极性组分别离)和反相分派色谱(震动相极性大于强固相极性，极性大的先流出，适于非极性或弱极性组分别离)。强固相：由载体和强固液构成。罕用的强固液有b，b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鲨烷等。运用：同系物组分的别离。例：别离水解卵白质所生成的各样氨基酸，别离脂肪酸同系物等。16.化学键合强固相：化学键合强固相是操纵化学反映将有机分子键合到载体表面上，产生均一、强固的单分子薄层而构成各样本能的强固相。17.化学键合强固相的特性：强固相不易散失，柱的不变性和寿命较高；本事受各样溶剂，可用于梯度洗脱；表面较为均一。没有液坑，传质快，柱效高；能键合不同基团以改动其取舍性。比方，键合氰基、氨基等极性团体用于正相色谱法，键合离子相易基团用于离子色谱法，键合C2、C4、C6、C8、C18、C16、C18、C22烷基和苯基等非极性基团用于反相色谱法等。因而，它是HPLC较为巴望的强固相。18.离子相易色谱法道理：离子相易色谱法的强固相是离子相易树脂，震动相是水溶液，它是操纵待测样本中各组别离子与离子相易树脂的亲和力的不同而实行别离的。19.离子相易色谱法震动相：水的缓冲溶液，阴离子离子相易树脂做强固相，采纳酸性水溶液；阳离子离子相易树脂做强固相，采纳碱性水溶液；运用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。20.凝胶色谱法道理：凝胶色谱法的强固相为多孔性凝胶类物资，震动相为水溶液或有机溶剂，它是依照不同组分分子体积的巨细实行别离的。小分子能够散布到凝胶清闲，由个中经过，出峰最慢；中平分子只可经过部份凝胶清闲，中速经过；而大分子被排挤在外，出峰最快；溶剂分子小，故在末了出峰。一块在死体积前出峰；可对相对分子品质在～领域内的化合物按品质别离。21.凝胶色谱法震动相：能消融样本且与凝胶彷佛(潮湿凝胶并防备吸附效用)、粘度小(添加散布速度)。罕用四氢呋喃、苯、氯仿、水等。22.影响别离的要素与提升柱效的路径:(1)液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍左右，故消沉传质阻力是提升柱效首要路径。(2)由速度方程，消沉强固相粒度可提升柱效。(3)液相色谱中，不行能经过添加柱温来改进传质。(4)恒温改动淋洗液构成、极性是改进别离的最直接的要素。

(5)流速大于0.5cm/s时,H～u弧线是一段斜率不大的直线。消沉流速，柱效提升不是很大。但在现实操纵中，流量照样一个调度别离度和出峰时光的首要可取舍参数。(6)气相色谱中的强固液规定上均能够用于液相色谱，其采用规定与气相色谱相同。但在高效液相色谱中，别离柱的制备是一项技巧请求稀奇高的劳动，通常很少自行制备。

质谱解析法

1.质谱法界说：是将待测物资置于离子源中电离产生带电离子，让离子加快并经过磁场或电场后，离子将按质荷比(m/z)巨细别离，产生质谱图。根据质谱线的地位和质谱线的相对强度树立的解析法子称为质谱法。2.质谱的效用：精确测定物资的分子量；质谱法是唯独能够肯定分子式的法子；依照碎片特性实行化合物的机关解析。3.质谱解析的基根源理：质谱法是操纵电磁学道理，将待测样本分子解离成具备不同品质的离子，尔后按其质荷比(m/z)的巨细次序胪列搜聚成质谱。依照质谱中的分子离子峰(M+)能够得到样本分子的相对分子品质消息；依照各离子峰(分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、重排离子峰等)及其相对强度和氮数规定，能够肯定化合物的分子式;依照各离子峰及物资化学键的断裂规律能够实行定性解析和机关解析；依照组分质谱峰的峰高与浓度间的线性关连能够实行定量解析。4.质谱解析的流程：（1）进样，化合物经过汽化引入电离室；（2）离子化，在电离室，组分分子被一束加快电子碰撞，撞击使分子电离产生正离子；（3）离子也可因撞击激烈而产生碎片离子；（4）荷正电离子被加快电压V加快，产生必要的速度v，与品质、电荷及加快电压相关；（5）加快正离子投入一个强度为B的磁场(品质解析器)，产生偏转。5.质谱仪的构成：真空系统、进样系统、离子源或电离室、品质解析器、离子探测器。6.真空系统效用：是缩小离子碰撞损失，若真空度低：大批氧会烧坏离子源的灯丝；会使本底增高，困扰质谱图；引发额外的离子-分子反映，改动裂解模子，使质谱说明繁杂化；困扰离子源中电子束的寻常调理；用做加快离子的几千伏高压会引发放电等。7.进样系统目标：高效反复地将样本引入到离子源中况且不能产生真空度的消沉；停止式进样系统——气体及低沸点、易挥发的液体;直接探针进样——高沸点的液体、固体；色谱进样系统——有机化合物。8.离子源或电离室：效用是使试样中的原子、分子电离成离子，其本能影响质谱仪的机灵度和分辩率才干。电子电离源的特性：电离电压：70eV；加一小磁场添加电离概率；EI源电离效率高,碎片离子多，机关消息充分，有准则化合物资谱库；机关简明，操纵便利；样本在气态下电离，不能汽化的样本不能解析，首要用于气-质联用仪；有些样本得不到分子离子。9.化学电离源特性：电离能小，质谱峰数少，谱图简明；最强峰为(M+1)+准分子离子峰；不实用难挥发试样。10.快原子轰击源：高能量的Xe原子轰击涂在靶上的样本，溅射出离子流。本法适当于高极性、大分子量、低蒸汽压、热不变性差的样本，FAB通常用做磁式质谱的离子源。11.电喷雾源机关：喷嘴(金属毛细管)，雾化气，干枯气。道理：喷雾挥发电压。特性：ESI是最软的一种电离方法，只产生份子离子，不产生碎片离子；实用于强极性，大分子量的样本解析，如，肽，卵白质，糖等；产生的离子带有多电荷，尤为是生物大分子；首要用于液相色谱-质谱联用仪，既用做液相色谱和质谱仪之间的接口安设，同时又是电离安设。12.场致电离源(FI)和场解吸电离源(FD)：分子离子峰强；碎片离子峰少；不适当化合物机关审定。13.基质扶助激光解吸电离特性：准分子离子峰很强且碎片离子少。通罕用于航行时光质谱，稀奇适当测定多肽、卵白质、DNA片断、多糖等的相对分子品质。14.品质解析器效用：将离子源产生的离子按质荷比m/z的巨细隔开。15.单聚焦解析器：离子的m/z与R，B，V相关。经过改动磁场能够把不同离子隔开。在必要磁感觉强度B下，改动加快电压V能够使不同离子前后经过探测器，完结品质扫描，得到质谱。特性：机关简明，操纵便利；惟独方位聚焦，能干量聚焦，分辩率低。16.双聚焦解析器：完结方位聚焦和能量(速度)聚焦；关于动能不同的离子，经过调理电场能，抵达聚焦的目标。特性：分辩率高。17.四级杆品质解析器：特性：机关简明，体积小、分量轻，扫描速度快，适当与色谱联机。18.航行时光品质解析器：特性：品质领域宽，扫描速度快，既不需磁场也不需电场，唯有要直线漂移空间。19.离子阱品质解析器：特定m/z离子在阱内必要轨道上不变扭转，改动端电极电压，不同m/z离子飞出阱抵达探测器。特性：机关简明、易于操纵、机灵度高。20.质谱的示意法子：质谱通常可用线谱或表谱两种法子示意，罕用线谱；线谱上的各条直线示意一个离子峰，横坐标为质荷比m/z，纵坐标为离子的相对强度(相对丰采)，通常将原始质谱图上最强的离子峰定为基峰并定为相对强度%，其余离子峰以对基峰的相对百分值示意。能够很直觉地观看到全面分子的质谱全貌；质谱表是用表格大局示意的质谱数据，质谱表中有两项即质荷等到相对强度，对定量计较较直觉。21.质谱仪的分辩率：分辩率(R)指质谱仪能差别附近两个质谱峰的技能，对两个相等强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时，则以为两峰曾经隔开。22.质谱图中首要离子峰的范例：分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、重排离子峰。23.相对分子品质的测定：分子离子峰的m/z相当于该化合物的相对分子品质。通常除同位素离子峰外，分子离子峰是质谱图中最大质荷比的峰，位于质谱图的最右端。24.确认分子离子峰的法子：(1)分子离子峰必需合乎氮数规定：有机化合物含有偶数个氮原子或不含氮原子，分子离子峰的m/z必要是偶数;含奇数个氮原子，分子离子峰的m/z必要是奇数；

(2)分子离子峰与相邻离子峰的品质差应正当，如，不行能呈现比分子离子峰品质小4～13个品质单元的峰；

(3)当化合物中含S，Br，Cl时，可操纵M+(M2+)+同等位素离子峰的比例来确认分子离子峰。

(4)改改动谱仪的操纵前提，提升分子离子峰的相对强度。

※采纳化学电离源或消沉电子轰击源电压可得到较强的M+峰。

25.气相色谱-质谱联用仪：

质谱：纯物资机关解析。

色谱：化合物别离，定本技能差。

色谱-质谱联用：配合长处，GC-MS、LC-MS、CE-MS，色谱是质谱的进样及别离系统，质谱是色谱的探测器。

首要题目：接口技巧，裁撤色谱中大批的震动相分子。

实用领域：实用于挥发度低、难气化、极性强、相对分子品质大及热不变性差的样本。

26.无损探测界说：

无损探测技巧即非摧残性探测，便是在不摧残待测物资从来的形态、化学性质等前提下，为获得与待测物的德行相关的体例、性质或成份等物理、化学谍报所采纳的检讨法子。

转自：试验室司理人

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